冷凍電鏡中心助力馮鈺課題組《Science》合作發文揭示植物獨特的轉錄機制

2022-01-12 13:11 發布人：系統管理員

2021年12月24日，中國科學院分子植物科學卓越創新中心張余研究團隊和王佳偉研究團隊以及浙江大學基礎醫學院馮鈺團隊合作在《科學》上發表題為“Pol IV and RDR2: A two-RNA-polymerase machine that produces double-stranded RNA”的研究論文，該研究首次解析了植物Pol IV的結構，揭示了植物Pol IV-RDR2兩種RNA聚合酶組裝成的獨特復合物構造，并提出了Pol IV-RDR2以底物內部傳遞的機制實現雙鏈DNA為模板合成雙鏈RNA。

研究背景 | Research Background

轉座子（transposon）最早由美國的遺傳學家Barbara McCl####ck（1983年諾貝爾生理和醫學獎）在玉米中發現，在細菌、病毒以及真核生物的基因組中廣泛分布。轉座子類似內源性病毒，能夠在宿主基因組中“復制和粘貼”自己的DNA，以達到其自我“繁殖”的目的?；钴S的轉座子對基因組的穩定構成嚴重威脅，高等生物通過對轉座子DNA進行甲基化修飾將其沉默來維持基因組的穩定性。

RNA導向的DNA甲基化（RdDM）途徑是高等植物基因組甲基化的重要途徑。在該途徑中，植物獨有的兩個RNA聚合酶（Pol IV和Pol V）發揮了核心作用。Pol IV與RDR2合作產生小干擾RNA的dsRNA前體，經過加工后形成24個堿基的小干擾RNA，隨后這些小干擾RNA在Argonaut蛋白的幫助下與RNA聚合酶Pol V產生的scaffold RNA配對，從而招募DNA甲基轉移酶（DRM2）完成DNA的甲基化。

Pol IV和Pol V作為真核生物的第四個和第五個多亞基RNA聚合酶，其基因轉錄區域、轉錄起始、延伸和終止機制、轉錄調控方式均和Pol I、 Pol II和Pol III有較大區別。Pol IV轉錄的獨特之處在于， Pol IV能夠與RDR2形成復合物，直接以雙鏈的基因組DNA為模板催化dsRNA的合成。雖然植物Pol IV和Pol V于2005年被發現，然而其三維結構仍然未被報導，大大阻礙了Pol IV和Pol V的進一步深入研究。

研究過程 | Research Process

在該工作中，研究人員克服了低豐度超大蛋白質復合物的制備瓶頸，通過擬南芥的懸浮細胞體系純化了內源的Pol IV-RDR2復合物，隨后通過冷凍電鏡單顆粒重構技術，解析了Pol IV-RDR2全酶和Pol IV-RDR2轉錄延伸復合物冷凍電鏡結構，并結合生物化學和遺傳學實驗進一步闡明了Pol IV和RDR2協作的分子機制。

三維結構支持Pol IV由Pol II進化而來，然而幾億年的進化使Pol IV的催化中心和外部結構單元與Pol II有所不同。首先，Pol IV蛋白的外部結構單元不能與TFIIB， TFIIE以及TFIIF等Pol II 特異轉錄起始因子相互作用，從而保證了Pol IV與Pol II的轉錄相互獨立。其次， Pol IV催化中心的核心元件發生變化，提示Pol IV轉錄過程容易發生停滯和倒退。

該研究最有意義的發現在于Pol IV和RDR2形成一個穩定的復合物，并且這兩個聚合酶的催化中心由一個內部的通道相連接，Pol IV以雙鏈DNA為模板合成的單鏈RNA通過這個內部通道直接傳遞給RDR2，從而RDR2能夠以這條單鏈RNA為模板輸出雙鏈RNA。據此，研究人員提出了Pol IV-RDR2復合物以RNA內部傳遞的機制實現雙鏈DNA為模板合成雙鏈RNA的模型。首先Pol IV在基因組DNA上前進，以雙鏈DNA為模板合成一定長度的單鏈RNA，在轉錄延伸過程中由于染色體的多重障礙以及Pol IV的內在性質導致Pol IV轉錄暫停并發生倒退，在Pol IV倒退的過程中，Pol IV合成的單鏈RNA從內部通道進入RDR2的催化中心，該單鏈RNA隨后被RDR2用作模板合成雙鏈RNA。RDR2在合成雙鏈RNA的過程中會促使Pol IV合成的單鏈RNA逐漸從Pol IV 的催化中心解離，最后RDR2完成雙鏈RNA的合成和釋放。上述特殊的作用機制能夠保證 Pol IV合成的單鏈RNA直接傳遞至RDR2，防止單鏈RNA的降解，另外，Pol IV-RDR2經過一輪雙鏈RNA合成之后，又回到轉錄起點，能夠開始下一輪雙鏈RNA合成，高效地實現了雙鏈RNA的擴增。

這項工作首次揭示了真核生物第四個多亞基RNA聚合酶的三維構造，闡明了兩種RNA聚合酶Pol IV和RDR2協作轉錄的獨特分子機制，回答了RdDM途徑中雙鏈RNA如何合成的科學問題。這一研究結果拓展了真核生物RNA聚合酶結構和功能的多樣性，加深了我們對植物表觀遺傳機制的理解。