冷凍電鏡助力沈華浩/張巖/應頌敏課題組《Nature Chem Biol》合作揭示哮喘治療新靶點趨化因子受體CCR1的偏向性信號激活機制

     2021年12月23日，浙江大學醫學院附屬第二醫院沈華浩/應頌敏團隊與浙江大學醫學院生物物理學系張巖團隊，共同在《Nature  Chemical Biology》發表了題為Identification and mechanism of G protein-biased ligands for chemokine receptor CCR1的研究成果。該研究在國際上首次報道了人源全長趨化因子受體CCR1的精細三維空間結構，闡明了該受體的內源性配體識別與偏向性信號激活機制，為今后靶向CCR1受體的藥物研發奠定了基礎。

    哮喘是全球常見的慢性疾病之一，患病率逐年增加。有數據顯示，哮喘在各個國家發病率為1-18%。全球已有哮喘患者逾4億人，我國20歲及以上哮喘患者人數已達4570萬。然而現有的治療策略下，哮喘的臨床控制仍不理想。因此，針對哮喘發病機制、病理過程以及新治療靶標的研究亟待突破。浙江大學醫學院附屬第二醫院呼吸與危重癥醫學科—浙江省呼吸疾病診治和研究重點實驗室沈華浩/應頌敏團隊經過多年科研攻關，明確了趨化因子受體CCR1的激活在哮喘炎癥中的關鍵作用，首次提出CCR1及其配體是哮喘治療的新靶標。然而，近二十年來，所有針對哮喘治療的靶向趨化因子受體的小分子藥物開發，在臨床II期實驗中均告失敗。因此，從分子層面解析CCR1如何識別內源性配體并激活下游通路機制，對理解趨化因子-趨化因子受體相互作用及靶向該受體的新藥研發具有重大意義。

     趨化因子受體CCR1屬于A類G蛋白偶聯受體（GPCR）。GPCR是人體中最大的細胞跨膜信號轉導受體和最重要的藥物靶標。據統計，近40%的FDA批準藥物以GPCR為靶點發揮藥效。浙江大學基礎醫學院張巖教授課題組長期從事GPCR信號轉導和結構藥理研究，解析了包括5-羥色胺受體（5-HT receptor）、多巴胺受體（D1R, D2R）、γ-氨基丁酸受體（GABAB receptor）等在內的多個重要藥物靶標的信號轉導機制。本研究中，沈華浩/應頌敏團隊和張巖團隊通力合作，成功解析了CCR1及其G蛋白復合物的高分辨率冷凍電鏡結構。結合基于結構的功能研究和計算機模擬結果，本研究還首次闡述了Tyr7.43在GPCR的配體識別和信號轉導中的關鍵作用。

炎癥狀態下，人體內金屬酶的分泌增加，會切割趨化因子CCL15的N端氨基酸，形成多種N端長度不同的CCL15。在該研究中，科研人員發現：N端長度不同的CCL15可以激活受體CCR1產生不同的下游信號。根據下游信號和N端長度的不同，他們CCL15因子分為三類——CCL15L、CCL15M和CCL15S（圖1）。這三類CCL15激活CCR1后產生相似的G蛋白信號，但CCL15S激活β-arrestin信號通路的能力顯著弱于CCL15L和CCL15M，即發生了偏向性信號轉導。

   為了探究該現象發生的機制，研究團隊采用單顆粒冷凍電鏡技術，首次解析了三個高分辨率的趨化因子受體CCR1與Gi蛋白的復合物結構（2.6~2.8埃）：分別是結合CCL15L、CCL15M和未結合配體的CCR1受體信號轉導復合物結構（圖2）。

研究發現：在不同類型配體作用下，CCR1正構結合口袋內的氨基酸構象存在顯著構象變化。電鏡密度顯示，位于CCR1正構結合口袋底部的Tyr2917.43氨基酸側鏈在不同配體作用下表現為截然不同的構象(圖3)。突變該氨基酸后，受體下游偏向性信號轉導特性幾乎完全消失，提示Tyr2917.43是介導CCL15對CCR1的偏向性激活的關鍵氨基酸位點。

分子動力學模擬結果同樣證明，受體結合口袋內的氨基酸構象與受體的胞內區動力學特征存在關聯。具體來說，參與識別下游效應蛋白的TM1、TM7 和H8的胞內區構象在不同配體形式下游明顯差異，影響了CCR1對β-arrestin的招募和信號激活。

有趣的是，研究者對所有人類GPCR進行序列比對，發現Tyr7.43在90余種A類GPCR中高度保守，如阿片類受體（μOR, κOR）、血管緊張素受體（AT1R）等。偏向性信號轉導機制的研究對于靶向GPCR的藥物發現有著重要意義：G蛋白和β-arrestin信號通路通常具有不同的生理功能和藥理學應用，特異性激活或抑制某一條信號通路可以有效避免藥物副反應，獲得高活性低副作用的理想化合物。例如阿片類受體μOR的G蛋白偏向性激動劑TRV130，被證明具有與嗎啡相似的止痛功效以更低的副作用，已獲得FDA批準上市。因此，該研究系統探索了Tyr7.43位點在受體響應外部信號激活中的作用，為未來靶向GPCR的偏向性藥物發現指明了道路。

本課題由浙江大學醫學院附屬第二醫院沈華浩教授、應頌敏教授課題組與基礎醫學院張巖教授課題組精誠合作，合力攻關完成。浙江大學醫學院蛋白質平臺、冷凍電鏡中心為本次研究的樣品制備和數據收集提供了支持。該工作也得到了中科院上海藥物研究所徐華強研究員的幫助。浙江大學醫學院附屬第二醫院呼吸與危重癥醫學科2017級直博生邵喆婳、浙江大學基礎醫學院博士后沈慶亞、2019級直博生姚冰鵬為該論文共同第一作者。浙江大學醫學院沈華浩、張巖、應頌敏教授為該論文共同通訊作者。